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當(dāng)前位置：
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR
來(lái)源: | 作者:proef7446 | 發(fā)布時(shí)間: 2132天前 | 3982 次瀏覽 | 分享到:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real-time Quantitative PCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具，目前已得到廣泛應(yīng)用（如轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物檢測(cè)、RNAi基因失活率檢測(cè)、病原微生物或病毒含量檢測(cè)、基因差異表達(dá)、基因分型）。
1. 熒光定量PCR分類(lèi)
TaqMan 熒光探針 
PCR 擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
SYBR Green熒光染料 
SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。SYBR Green法價(jià)格經(jīng)濟(jì)，對(duì)于常規(guī)樣本的基因表達(dá)量檢測(cè)，具有方便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。賽哲擁有的強(qiáng)大引物庫(kù)及各類(lèi)型樣本和基因檢測(cè)方案更是為數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性提供了強(qiáng)有力的保證。但由于染料可與所有的雙鏈DNA結(jié)合，其特異性和靈敏度較弱，因此對(duì)于一些特殊樣本（如血清樣本）或應(yīng)用（如病毒分型、SNP檢測(cè)），則推薦使用探針?lè)ā?/span>
2. 科研實(shí)例
使用探針?lè)z測(cè)某SNP位點(diǎn)

某SNP位點(diǎn)分析結(jié)果
A. 純合(G/G)，B. 雜合(G/T)


SNP分型散點(diǎn)圖
SYBR Green 染料法檢測(cè)人母乳中 miR-124 在不同時(shí)間的表達(dá)水平變化


 擴(kuò)增曲線和熔解曲線


 miR-124在不同時(shí)間的表達(dá)水平變化

3. 服務(wù)內(nèi)容和流程
根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因以及看家基因的引物；
提取RNA，通過(guò)A260/A280測(cè)定RNA的濃度和純度；
將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；
實(shí)時(shí)熒光定量PCR；
數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)報(bào)告整理。
4. 客戶(hù)提供
待檢測(cè)基因信息；
客戶(hù)提供新鮮或凍存的樣本。
5. 百菱生物提供
熒光定量PCR檢測(cè)原始數(shù)據(jù)；
擴(kuò)增曲線及溶解曲線；
結(jié)果分析。