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實時熒光定量 PCR
來源: | 作者:proef7446 | 發(fā)布時間: 2127天前 | 3956 次瀏覽 | 分享到:
實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-time Quantitative PCR），是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。熒光定量PCR以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點成為了分子生物學研究中的重要工具，目前已得到廣泛應用（如轉(zhuǎn)基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達、基因分型）。
1. 熒光定量PCR分類
TaqMan 熒光探針 
PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
SYBR Green熒光染料 
SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強。SYBR Green法價格經(jīng)濟，對于常規(guī)樣本的基因表達量檢測，具有方便、快速、準確、重復性好的優(yōu)點。賽哲擁有的強大引物庫及各類型樣本和基因檢測方案更是為數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性提供了強有力的保證。但由于染料可與所有的雙鏈DNA結(jié)合，其特異性和靈敏度較弱，因此對于一些特殊樣本（如血清樣本）或應用（如病毒分型、SNP檢測），則推薦使用探針法。
2. 科研實例
使用探針法檢測某SNP位點

某SNP位點分析結(jié)果
A. 純合(G/G)，B. 雜合(G/T)


SNP分型散點圖
SYBR Green 染料法檢測人母乳中 miR-124 在不同時間的表達水平變化


 擴增曲線和熔解曲線


 miR-124在不同時間的表達水平變化

3. 服務內(nèi)容和流程
根據(jù)基因序列設(shè)計擴增目的基因以及看家基因的引物；
提取RNA，通過A260/A280測定RNA的濃度和純度；
將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；
實時熒光定量PCR；
數(shù)據(jù)分析，實驗報告整理。
4. 客戶提供
待檢測基因信息；
客戶提供新鮮或凍存的樣本。
5. 百菱生物提供
熒光定量PCR檢測原始數(shù)據(jù)；
擴增曲線及溶解曲線；
結(jié)果分析。