此文章轉(zhuǎn)載自：百代生物
siRNA轉(zhuǎn)染是分子生物學(xué)常見的實(shí)驗(yàn)之一。在siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，siRNA轉(zhuǎn)染試劑的選擇尤為關(guān)鍵，需要綜合考慮轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染性能、細(xì)胞毒性和操作方便性。
目前，實(shí)驗(yàn)室常用的siRNA轉(zhuǎn)染試劑品牌主要有賽默飛的Lipo3000、 RNAiMAX和百代生物的RFect與RFect V2。
其中，RNAiMAX是國際公認(rèn)的siRNA轉(zhuǎn)染試劑權(quán)威產(chǎn)品，RFect是國產(chǎn)知名siRNA轉(zhuǎn)染試劑，RFect V2是RFect 的最新升級產(chǎn)品，很多實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)其siRNA轉(zhuǎn)染性能非常優(yōu)異。
RNAiMAX與RFect V2比較，各自的siRNA轉(zhuǎn)染性能如何，本文擬簡要敘述如下。
一、siRNA轉(zhuǎn)染性能
siRNA轉(zhuǎn)染性能，無疑是評價(jià)一款siRNA轉(zhuǎn)染試劑實(shí)力的首要指標(biāo)。不僅要看轉(zhuǎn)染陽性率，更要看基因沉默效率。
RFect V2的最大突破就是專門配置了Trans Enhancer，又叫siRNA轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，可有效降低細(xì)胞膜的免疫排異反應(yīng)的同時(shí)，顯著提升了siRNA轉(zhuǎn)染的效率，較升級前的RFect siRNA轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率還可高出5-30%。
那它的轉(zhuǎn)染性能表現(xiàn)和RNAiMAX相比又如何呢？我們實(shí)驗(yàn)室按照兩款試劑的說明書，以24孔板的推薦比例，在用于做體外質(zhì)控的Hela細(xì)胞融合度達(dá)到30-50%時(shí)，
分別以1.5μL的RFect V2和1.5μL的RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48h在熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染陽性率。
結(jié)果顯示，兩者的轉(zhuǎn)染陽性率都可達(dá)90以上，說明同等量的轉(zhuǎn)染試劑，RFect V2與RNAiMAX的轉(zhuǎn)染陽性率不相上下。
如果說轉(zhuǎn)染陽性率只是一個(gè)直觀的結(jié)果，并非是驗(yàn)證兩者轉(zhuǎn)染性能的“金標(biāo)準(zhǔn)”，那么還需要通過RT-qPCR來檢測其基因沉默效率從而得出結(jié)論。
為此，我們將能夠敲降SSB基因的小干擾核酸分別通過RFect V2和RNAiMAX轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞，利用RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染24h后SSB的mRNA表達(dá)水平。
如圖所示，使用RNAiMAX轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組CT值分別為21.91、21.95，使用RFect V2實(shí)驗(yàn)組的熒光定量檢測結(jié)果相比于RNAiMAX略高出0.13-0.14個(gè)CT值，兩者結(jié)果非常相近，表明RFect V2和RNAiMAX轉(zhuǎn)染siRNA沉默基因的效率基本一致。
二、細(xì)胞毒性
細(xì)胞死亡率對細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響很大，尤其是我們在研究基因沉默效率時(shí)，死亡細(xì)胞的那部分也會表現(xiàn)為目標(biāo)mRNA表達(dá)水平的降低，因此siRNA轉(zhuǎn)染試劑必須對細(xì)胞作用溫和，才能實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。
RFect V2使用了新型可降解納米材料，和升級前的RFect相比，細(xì)胞毒性更低，并且成分上區(qū)別于以陽離子脂質(zhì)體為主要成分的RNAiMAX。
眾所周知，siRNA轉(zhuǎn)染試劑的毒性越低，其要求的轉(zhuǎn)染密度也越低。
在這方面，無論是RNAiMAX，還是RFect V2，都做到了轉(zhuǎn)染密度在30-50%時(shí)就能取得高效的轉(zhuǎn)染結(jié)果。
根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，使用RNAiMAX轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，細(xì)胞死亡率約為10%左右，使用RFect V2轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，細(xì)胞死亡率只有5%左右，似乎還略優(yōu)于RNAiMAX。
可以說，RFect V2在細(xì)胞毒性方面的表現(xiàn)是令人驚喜的。
三、操作簡便性 以研究者的角度出發(fā)，實(shí)驗(yàn)的簡便性也十分重要。主要看兩方面，一方面是需不需要特殊培養(yǎng)基，第二方面是需不需要換液。
特殊培養(yǎng)基一般是用來配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物的，因?yàn)檠宓拇嬖谕鶗绊戅D(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，所以說必須使用減血清培養(yǎng)基或是無血清培養(yǎng)基。
RNAiMAX的說明書中就已明確指出需要使用Opti-MEM減血清培養(yǎng)基來稀釋轉(zhuǎn)染試劑和siRNA，而試劑盒內(nèi)并不提供這種培養(yǎng)基，因此實(shí)驗(yàn)者還需額外購買。
這方面，RFect V2盒內(nèi)配置有專研的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，可完全替代無血清培養(yǎng)基，不僅提升了轉(zhuǎn)染效率，也省去了購買特殊培養(yǎng)基的開支，為研究者提供了便利。
在換液問題上，研究者要根據(jù)每個(gè)轉(zhuǎn)染試劑的說明書來。
RFect V2不僅有很強(qiáng)的抗血清干擾能力，無需在轉(zhuǎn)染前更換無血清培養(yǎng)基，而且由于對細(xì)胞毒性極低，因此也無需在轉(zhuǎn)染4-6h后進(jìn)行換液，換液反而可能造成轉(zhuǎn)染效率降低。
RNAiMAX同樣在說明書中表明無需換液，但有些科研者在分享轉(zhuǎn)染經(jīng)驗(yàn)時(shí)還是建議轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)最好更換培養(yǎng)液，可能對于一些敏感的細(xì)胞如果不及時(shí)更換新鮮的培養(yǎng)基，細(xì)胞死亡率還是比較高的。
不過，對于大多數(shù)耐受性強(qiáng)的細(xì)胞，RNAiMAX還是有非常不錯(cuò)的轉(zhuǎn)染效率的。因而，研究者在選擇使用RNAiMAX時(shí)，可根據(jù)細(xì)胞對轉(zhuǎn)染試劑的敏感度自行判斷是否需要換液。
總的來說，RFect V2在各方面都有媲美RNAiMAX的性能，對于研究者來說，確實(shí)是一個(gè)不錯(cuò)的siRNA轉(zhuǎn)染試劑新選擇。
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