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知識(shí)科普-逆轉(zhuǎn)錄酶知多少？（二）
來源: | 作者:百菱生物 | 發(fā)布時(shí)間: 744天前 | 3120 次瀏覽 | 分享到:

此文章轉(zhuǎn)載自:莫納生物


小伙伴們大家好！上一期帶大家了解了酶的發(fā)現(xiàn)、逆轉(zhuǎn)錄過程和逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV 與 AMV 的區(qū)別。


今天，將為您帶來逆轉(zhuǎn)錄酶系列第二部分——逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H 活性和熱穩(wěn)定性。



RNase H 活性



一般情況下，病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)連接一個(gè) RNase H 活性結(jié)構(gòu)域。RNase H 活性可能會(huì)與逆轉(zhuǎn)錄酶的活性聚合酶相互競(jìng)爭(zhēng) RNA 模板，在 cDNA 合成過程中同時(shí)切割 RNA : cDNA 雜合鏈中的 RNA 模板。因此在全長(zhǎng)逆轉(zhuǎn)錄完成之前RNA 模板很有可能被降解掉。為了更好地合成 cDNA，提高逆轉(zhuǎn)錄效率，會(huì)在逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H 結(jié)構(gòu)域中引入突變，從而使逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H 活性降低甚至完全消除。這種突變常?？梢栽黾娱L(zhǎng)鏈 cDNAs 的產(chǎn)量，促進(jìn)其合成。所以在長(zhǎng)片段 cDNA 合成過程中 RNase H 活性是必須要考慮且是需要規(guī)避掉的因素。

 cDNA 合成過程中逆轉(zhuǎn)錄酶中的 RNase  H  活性



熱穩(wěn)定性


RNA 是由核糖核苷酸經(jīng)磷酸雙酯鍵縮合而成長(zhǎng)鏈狀分子。與 DNA（脫氧核糖核酸）不同的是，RNA 一般為單股長(zhǎng)分子，但在一般水溶液中會(huì)形成分子內(nèi)雙螺旋結(jié)構(gòu)。此外，RNA 本身也需要通過堿基配對(duì)原則形成一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)乃至三級(jí)結(jié)構(gòu)來行使生物學(xué)功能。RNA 的堿基配對(duì)規(guī)則基本上和 DNA 相同，不過其中尿嘧啶在配對(duì)上的作用，相當(dāng)于 DNA 中的胸腺嘧啶。

在逆轉(zhuǎn)錄過程中通常需要高溫使 RNA 成單鏈狀態(tài)，升高反應(yīng)溫度有助于堅(jiān)固二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或高 GC 含量的 RNA 變性，使得逆轉(zhuǎn)錄酶能夠更好的讀取序列。因此逆轉(zhuǎn)錄酶耐受高溫的能力是 cDNA 合成的重要影響因素。在反應(yīng)溫度較高的情況下，逆轉(zhuǎn)錄能夠?qū)崿F(xiàn)全長(zhǎng) cDNA 合成，產(chǎn)量更高，進(jìn)而使 RNA 能夠更好地逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 。


野生型 AMV 的 RNase H 活性較高，cDNA 合成率較低。而野生型 M-MLV 的 RNase H 活性較低，并且 cDNA 合成率較高，這點(diǎn)滿足逆轉(zhuǎn)錄酶的需求。但它也有熱穩(wěn)定性差，抵抗二級(jí)結(jié)構(gòu)能力弱的缺點(diǎn)，而這些缺點(diǎn)我們可以經(jīng)過基因工程改造來彌補(bǔ)不足。為了提高 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性，Aurimas 等人采用了區(qū)劃核糖體展示技術(shù)（CRD）鑒定了 D200N、L603W、T330P、L139P、E607K 等高持續(xù)合成能力和耐熱穩(wěn)定性的多突變MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶變體。這種高度耐熱的逆轉(zhuǎn)錄酶特別適用于從富含 GC 的 RNA 模板 合成 cDNA。因此，RNase H 活性較低、可耐高溫的 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶是更好的選擇。


通過了解逆轉(zhuǎn)錄酶 RNase H 活性和熱穩(wěn)定性的特性，大家對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶有了更深層次的了解，對(duì)于如何選擇逆轉(zhuǎn)錄酶，自己初步有一定的判斷了。

下一期我繼續(xù)帶大家了解逆轉(zhuǎn)錄酶持續(xù)合成能力、保真度和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）活性對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響，讓大家全方位了解逆轉(zhuǎn)錄酶，大家敬請(qǐng)期待吧！


莫納生物逆轉(zhuǎn)錄酶
具有高熱穩(wěn)定性，較低 RNase H 活性
大幅提升了逆轉(zhuǎn)錄效率和 RNA 復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的耐受性，特異性更好、產(chǎn)率更高、更容易獲得全長(zhǎng) cDNA，最長(zhǎng)可達(dá) 12kb 

 



莫納生物一步法與兩步法產(chǎn)品區(qū)別



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參考文獻(xiàn)


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