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干貨課堂 | qPCR 樣品前處理

來源: | 作者:百菱生物 | 發(fā)布時(shí)間: 713天前 | 2770 次瀏覽 | 分享到:

此文章轉(zhuǎn)載自：莫納生物Monad

qPCR，即 Real Time PCR，也被稱為實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，是實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)。上一期我們講了 qPCR 的學(xué)術(shù)用語和數(shù)學(xué)原理，這一期我們主要講 qPCR 的樣品前處理。

樣品采集

樣品采集是造成試驗(yàn)差異的第一個(gè)潛在來源，特別是對(duì)檢測(cè) RNA 的試驗(yàn)。

RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一類能夠催化 RNA 降解為小分子 RNA 的核酸酶，廣泛存在于真核生物、原核生物的所有細(xì)胞和組織中，通常具有極強(qiáng)活性，RNA 樣本中微量的 RNase 污染，就足以導(dǎo)致 RNA 樣本完全降解。

外源性污染源

對(duì)于外源性污染源，就需要在操作細(xì)節(jié)上注意，應(yīng)該使用 RNase free 耗材，高溫或 DEPC 處理的器皿，使用 RNA 實(shí)驗(yàn)專用試劑，操作時(shí)戴口罩、手套，設(shè)置 RNA Free 工作區(qū)，避免交叉污染。

內(nèi)源性污染源

對(duì)于內(nèi)源性污染源，就需要在材料處理與保存方面注意。將材料保存在冰箱或者液氮中能夠很好的維持材料中核酸的穩(wěn)定性。有條件的情況下應(yīng)該立即提取或者液氮速凍。

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RNA 純度檢測(cè)

RNA 的純度會(huì)影響 cDNA 的合成量，所以在提取 RNA 后需要進(jìn)行 RNA 純度和質(zhì)量檢測(cè)。RNA 中的蛋白質(zhì)等有機(jī)物污染程度用 OD260/ OD280 來表示。

①1.8 < A260/280 < 2.0 為 RNA 質(zhì)量較好，符合要求。

②當(dāng) A260/ 280 < 1.8 時(shí)：表示蛋白或者其他有機(jī)物的污染比較明顯。

③當(dāng) A260/ 280 > 2.2 時(shí)：表示 RNA 已經(jīng)水解成單核酸。

莫納的超微量核酸蛋白檢測(cè)儀，有全波長(zhǎng)，三種光程，樣品檢測(cè)濃度范圍大，有微量檢測(cè)和比色皿兩種檢測(cè)模式，操作簡(jiǎn)單，可快速檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞溶液。

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RNA 完整性檢測(cè)

RNA 完整性采用瓊脂糖凝膠電泳的方式進(jìn)行檢測(cè)。

完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的 28S 和 18S rRNA 條帶（真核樣品）。28S rRNA 條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為 18S rRNA 條帶的兩倍。這種 2:1 的比率（28S：18S）是判斷 RNA 完整性的一個(gè)很好的指標(biāo)。最下面可能有淡淡的條帶 5.8S tRNA 等。如果觀察到有條帶大于 28S，就說明樣品中可能有基因組 DNA 的污染，這時(shí)候就需要使用 DNase I 進(jìn)行處理。

Luna凝膠成像系統(tǒng)

基因組 DNA 污染

RNA 提取時(shí)，最值得注意的就是基因組 DNA 的污染物。那何時(shí)去除基因組 DNA 污染？一種是在 RNA 提取過程中去除，還有一種是在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前去除。

為什么要去除基因組 DNA 的污染呢？如下圖，反應(yīng) 3 是去除基因組進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，反應(yīng) 4 是去除基因組不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，反應(yīng) 3 和反應(yīng) 4 的結(jié)果就是正常的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但是我們看反應(yīng) 1 和反應(yīng) 2，他們分別是不去除基因組進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和不去除基因組不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)他們兩個(gè)在所做的熒光定量實(shí)驗(yàn)中都檢測(cè)出了信號(hào)。由此可看出，基因組 DNA 的殘留對(duì) qPCR 結(jié)果會(huì)造成很嚴(yán)重的影響。所以我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中應(yīng)該盡可能的把基因組 DNA 去除掉，從而保證我們數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)溫度是關(guān)鍵，高溫有利于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，有助于全長(zhǎng) cDNA 的合成，獲得完整的 cDNA 產(chǎn)物。

對(duì)于 37/ 42℃ 常規(guī)孵育來說，復(fù)雜的 RNA 模板二級(jí)結(jié)構(gòu)未充分打開，從而阻礙了 cDNA 的合成。在 55℃ 高溫孵育的條件下，復(fù)雜 RNA 模板二級(jí)結(jié)構(gòu)在高溫下會(huì)充分打開，因此 cDNA 的合成會(huì)繼續(xù)。

因此我們要選擇：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度更高的產(chǎn)品進(jìn)行 cDNA 的合成！

莫納生物逆轉(zhuǎn)錄酶

有更高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度最高可達(dá) 55℃，獲得 cDNA 產(chǎn)量更高，具有更完整的基因代表性，較低 RNase H 活性。

大幅提升了逆轉(zhuǎn)錄效率和 RNA 復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的耐受性，特異性更好、產(chǎn)率更高、更容易獲得全長(zhǎng) cDNA。

一步法和兩步法的區(qū)別

兩步法是分兩步進(jìn)行，就是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR兩個(gè)反應(yīng)，先完成反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物為通用引物，后以cDNA為模板進(jìn)行后續(xù)qPCR檢測(cè)。

一步法是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR反應(yīng)在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，先完成反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物為基因特異性引物（GSP），然后直接進(jìn)行擴(kuò)增，得不到cDNA。一步法操作簡(jiǎn)單，污染幾率低。

適用范圍：基因表達(dá)解析等目的基因數(shù)多，樣品數(shù)少，適合兩步法；病毒、病原菌檢測(cè)，樣品數(shù)多，適合一步法。