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細(xì)胞轉(zhuǎn)染
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作者:proef7446
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發(fā)布時(shí)間: 2132天前
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1.質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染
質(zhì)脂體為人工膜泡，可作為體內(nèi)、體外物質(zhì)轉(zhuǎn)送載體。將需轉(zhuǎn)移的DNA或RNA包裹于質(zhì)脂體，由于質(zhì)脂體具有磷脂雙層與胞膜相似，因此，可與細(xì)胞膜融合，將DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率差異的主要原因是細(xì)胞系間個(gè)體的差異，有的細(xì)胞系本生不容易被轉(zhuǎn)染，而有的細(xì)胞系細(xì)胞膜通透性較好，質(zhì)脂體復(fù)合物較容易進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率就高。其次脂類與DNA形成易于轉(zhuǎn)染結(jié)構(gòu)的特性存在負(fù)面效應(yīng)，其中主要的問題是毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞聚集在一起，從壁上脫落。另外脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染容易受到血清中的脂肪、脂蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)中帶電成分（如硫酸軟骨素等）干擾引起細(xì)胞死亡，從而影響轉(zhuǎn)染效率。
2.電穿孔轉(zhuǎn)染
核酸不能自動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，需要協(xié)助才能穿過細(xì)胞壁的物理屏障進(jìn)入能夠進(jìn)行表達(dá)和/或復(fù)制的胞內(nèi)位點(diǎn)。電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔。電穿孔的主要應(yīng)用優(yōu)勢是適用的細(xì)胞范圍廣，不論真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞都能被有效轉(zhuǎn)染。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時(shí)建議使用電穿孔轉(zhuǎn)染。
一般情況下，高電場強(qiáng)度會殺死50~70%的細(xì)胞。這種致命的后果根據(jù)細(xì)胞系的不同而異，與加熱或電解無關(guān)，也與當(dāng)時(shí)施加的能量與密度無關(guān)。相反，細(xì)胞死亡與電場強(qiáng)度、整體作用時(shí)間相關(guān)。賽哲針對細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑，大大的降低了細(xì)胞的死亡率，同時(shí)也提高了電穿孔轉(zhuǎn)染效率。
3.DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染
DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理尚不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度、細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖（1g/L）作用較短時(shí)間（30~90min），又可用較低濃度（250g/L）的DEAE-葡聚糖作用較長時(shí)間（8h）。
4.磷酸鈣-DNA共沉淀法
核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA僅有1~5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究，此方法對于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是最常用并首選的方法。
5.科研實(shí)例
質(zhì)脂體為人工膜泡，可作為體內(nèi)、體外物質(zhì)轉(zhuǎn)送載體。將需轉(zhuǎn)移的DNA或RNA包裹于質(zhì)脂體，由于質(zhì)脂體具有磷脂雙層與胞膜相似，因此，可與細(xì)胞膜融合，將DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率差異的主要原因是細(xì)胞系間個(gè)體的差異，有的細(xì)胞系本生不容易被轉(zhuǎn)染，而有的細(xì)胞系細(xì)胞膜通透性較好，質(zhì)脂體復(fù)合物較容易進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率就高。其次脂類與DNA形成易于轉(zhuǎn)染結(jié)構(gòu)的特性存在負(fù)面效應(yīng)，其中主要的問題是毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞聚集在一起，從壁上脫落。另外脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染容易受到血清中的脂肪、脂蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)中帶電成分（如硫酸軟骨素等）干擾引起細(xì)胞死亡，從而影響轉(zhuǎn)染效率。
2.電穿孔轉(zhuǎn)染
核酸不能自動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，需要協(xié)助才能穿過細(xì)胞壁的物理屏障進(jìn)入能夠進(jìn)行表達(dá)和/或復(fù)制的胞內(nèi)位點(diǎn)。電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔。電穿孔的主要應(yīng)用優(yōu)勢是適用的細(xì)胞范圍廣，不論真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞都能被有效轉(zhuǎn)染。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時(shí)建議使用電穿孔轉(zhuǎn)染。
一般情況下，高電場強(qiáng)度會殺死50~70%的細(xì)胞。這種致命的后果根據(jù)細(xì)胞系的不同而異，與加熱或電解無關(guān)，也與當(dāng)時(shí)施加的能量與密度無關(guān)。相反，細(xì)胞死亡與電場強(qiáng)度、整體作用時(shí)間相關(guān)。賽哲針對細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑，大大的降低了細(xì)胞的死亡率，同時(shí)也提高了電穿孔轉(zhuǎn)染效率。
3.DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染
DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理尚不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度、細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖（1g/L）作用較短時(shí)間（30~90min），又可用較低濃度（250g/L）的DEAE-葡聚糖作用較長時(shí)間（8h）。
4.磷酸鈣-DNA共沉淀法
核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA僅有1~5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究，此方法對于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是最常用并首選的方法。
5.科研實(shí)例
轉(zhuǎn)染帶有EGFP熒光標(biāo)記質(zhì)粒結(jié)果圖
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