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實驗技術 | PCR實用tips 請查收！
來源: | 作者:百菱生物 | 發(fā)布時間: 704天前 | 1807 次瀏覽 | 分享到:

此文章轉(zhuǎn)載自：無錫耐思NEST





PCR（Polymerase Chain Reaction）是1983年由Kary Mullis發(fā)明，至今仍廣泛使用的DNA擴增技術。它通過高溫解鏈、低溫退火、中溫擴增的過程，來實現(xiàn)目標片段DNA的指數(shù)級擴增。


PCR反應體系可以簡單概括為三部分：DNA模板（Template）、引物（Primer）及DNA聚合酶預混液（PreMix，MasterMix等），其中商業(yè)化的DNA聚合酶產(chǎn)品預混液已包括濃度優(yōu)化過的DNA聚合酶、三磷酸核苷（NTPs）、Mg2+、緩沖液及惰性染料等，可以根據(jù)實驗需要選擇擴增速度、保真性不同的DNA聚合酶以及預混染料的產(chǎn)品。整個體系經(jīng)常為20μL或50μL的體積，可置于0.1mL或0.2mL的PCR管中。


PCR熱循環(huán)儀是實現(xiàn)PCR反應的外部硬件，按照設定的反應程序，利用金屬浴來按時加熱、冷卻PCR反應體系來完成解鏈、退火和擴增的過程。溫度和時間的設定受引物Tm（DNA Melting Temperature，熔解溫度）、目標序列長度及DNA聚合酶擴增速度影響。一個典型的PCR程序如下：

PCR體系組分的Tips：



1. DNA模板
a)起始模板含量依據(jù)DNA類型及DNA聚合酶性質(zhì)來決定。一般質(zhì)粒DNA模板起始含量為0.1~1ng，基因組DNA以5-50ng為佳，例如25ng/μL的基因組DNA模板，加1μL左右就夠了。過少的模板會降低得率，過多則會導致非特異性擴增。
b)模板提取過程中，模板完整性受到損壞或提取試劑殘留都可能會導致PCR反應失敗。PCR反應出現(xiàn)不擴增或異常時，可以考慮用電泳檢驗DNA完整性以及使用Nanodrop測定DNA純度來排除問題。
2. 引物
a)引物設計對長度、堿基構成、序列有很多限制，但目前很多軟件都可以輔助引物設計來規(guī)避可能出現(xiàn)的問題。擴增引物和用于引入點突變的引物都可以借助軟件來設計。
b)引物終濃度需要控制在適配DNA聚合酶的范圍內(nèi)，實際使用時可以將上下游引物預混直接加入，減少時間及槍頭成本哦。
3. 水
一定要用不含DNA酶（DNase-free）的水，也可以預混到引物里面，算好濃度和體積就行，體系不足的體積都由水來補足。

4. DNA聚合酶預混液

a)最后加入體系以保證對存貨（stock）的最小污染，加完后可用槍頭緩慢混勻。

b)直接上電泳的基因分型實驗可以選擇預混Loading buffer的DNA聚合酶，省去了很多加樣的時間。


PCR結束后應盡量當天進行后續(xù)實驗，或?qū)a(chǎn)物置于4℃短期保存哦。

稀釋系數(shù)tips：1）10X的溶液20μL體系中加2μL，2X的溶液20μL體系中加10μL；2）4X溶液與4X溶液等體積混合后為2X預混液（Premix）。

最后劃重點，每次PCR實驗時不要忘了包括陰性和陽性對照。


附：可使用到的NEST產(chǎn)品


 PCR系列 

 點擊圖片可查看產(chǎn)品詳情 






 移液吸頭 

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 微量離心管 

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