Western blot實(shí)驗(yàn)流程

目的蛋白分子量為何與實(shí)際不符？

a)翻譯后修飾：蛋白發(fā)生如磷酸化、糖基化等翻譯后修飾時(shí)分子量會(huì)增加；

b)翻譯后剪切：蛋白發(fā)生剪切時(shí)分子量會(huì)降低，某些蛋白在合成時(shí)是作為前提蛋白合成的，然后剪切形成活性形式；

c)剪切異構(gòu)體：同一基因經(jīng)不同剪切方式可能產(chǎn)生不同大小的蛋白；

d)多聚體：比如蛋白二聚化；

e)電泳，膠濃度，蛋白Marker等因素也會(huì)影響是實(shí)際蛋白分子量的判斷。

如何提高上樣量？

1)可以濃縮樣品；或增大上樣體積來增大上樣量；

2)用5X的上樣緩沖液來稀釋變性。

轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)？

1)濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙≥膜≥膠。

2)濾紙、膠、膜之間千萬(wàn)不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。

3)保持膜的濕潤(rùn)，若FVDF膜干燥，需要重新用甲醇活化

為什么Western blot 背景高？

1)膜封閉不夠-延長(zhǎng)封閉的時(shí)間，可以選擇快速封閉液

（如碧云天的P0252 QuickBlock Western封閉液為進(jìn)一步提高信噪比，推薦同時(shí)使用QuickBlock Western一抗稀釋液(P0256)和QuickBlock? Western二抗稀釋液(P0258)進(jìn)行一抗及二抗的稀釋。）

2)一抗稀釋度不適宜-對(duì)抗體進(jìn)行滴度測(cè)試，選擇適宜的抗體稀釋度

3)檢測(cè)時(shí)曝光時(shí)間過長(zhǎng)-調(diào)整合適的曝光時(shí)間。

為什么條帶形狀不好看？

1）膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻

2）某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致

3) 緩沖液陳舊，成分改變,可以重配

4) 凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走

5）電泳時(shí)溫度過高，可以降低電流或電壓

6）樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分?jǐn)嚢杌靹?/span>

為什么蛋白條帶位置（大?。┎粚?duì)？

1）膠濃度不對(duì)，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度

2）抗體孵育不充分,建議增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間

3）酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定

5）標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照比對(duì)結(jié)果，增加標(biāo)本上樣量

WB實(shí)驗(yàn)中其他常見的問題

可能出現(xiàn)問題	原因	參考解決方案
相同蛋白雜交出現(xiàn)大小不均勻條帶	制備凝膠時(shí)凝膠凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均勻	調(diào)整促凝劑的用量
目的條帶染色過高/過低	分離不徹底	分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠
深背景出現(xiàn)白色條帶	一抗或二抗加入過多	稀釋抗體的濃度
背景有黑色斑點(diǎn)	抗體結(jié)合了封閉劑	過濾封閉劑
背景有不均勻的白色斑點(diǎn)	轉(zhuǎn)膜時(shí)膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均	轉(zhuǎn)膜過程中盡量去除氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)